معرف برای تراکم پپتید

در حال حاضر در سنتز پپتیدها عمدتاً از روش های فعال سازی کربوکسیل برای تکمیل واکنش های پپتیدی استفاده می شود. اولین روش های مورد استفاده برای فعال کردن اسیدهای آمینه به کلریدهای اسیدی، آزیدها، انیدریدهای متقارن و انیدریدهای اسیدی مخلوط بود. اما به دلیل وجود راسمی شدن اسید آمینه در این شرایط، خطر معرف‌های واکنش و پیچیدگی آماده‌سازی، به تدریج جایگزین معرف‌های تراکمی بعدی شدند که می‌توان آن‌ها را با توجه به ساختارشان به دو نوع تقسیم کرد.

به طور عمده شامل: DCC، DIC، EDC.HCl صبر کنید. استفاده از DCC واکنش را انجام دهید، به دلیل وجود DCU، وجود DMF حلالیت بسیار کمی دارد و رسوب سفید تولید می کند، بنابراین معمولاً در سنتز فاز جامد استفاده نمی شود. با این حال، از آنجایی که ارزان است، می توان آن را با فیلتراسیون در سنتز فاز مایع حذف کرد و هنوز هم به طور گسترده استفاده می شود. EDC.HCl به دلیل حلالیت در آب، اغلب در اتصال پلی پپتیدها و پروتئین ها استفاده می شود و همچنین کاملاً موفق است. با این حال، یکی از بزرگترین معایب این نوع معرف تراکمی این است که در صورت استفاده به تنهایی، واکنش های جانبی بیشتری به همراه خواهد داشت. با این حال، تحقیقات نشان می‌دهد که اگر در طی فرآیند فعال‌سازی HOBt، HOAt اضافه شود، چنین معرف‌هایی می‌توانند واکنش‌های جانبی را تا محدوده بسیار پایین کنترل کنند. مکانیسم واکنش به شرح زیر است:

شکل 2 مکانیسم واکنش فعال سازی DIC

معرف های چگالشی نوع نمک اونیوم واکنش پذیری بالا و سرعت بالایی دارند و در حال حاضر به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرند که عمدتاً شامل موارد زیر است: انتظار HBTU، TBTU، HATU، PyBOP. در طول استفاده از این معرف باید یک پایه آلی مانند دی ایزوپروپیل اتیلامین (DIEA)، N{1}} متیل مورفولین (NMM) اضافه شود، اسید آمینه تنها پس از افزودن این معرف می تواند فعال شود. مکانیسم واکنش به شرح زیر است:

رزین‌های مورد استفاده در سنتز پپتید فاز جامد معمولاً پلی استایرن-دیوینیل بنزن می‌باشند، با اندازه‌های 75 تا 150 میکرومتر، درجه پیوند متقابل-بین 1-2% است و اکثر مواردی که اکنون استفاده می‌شوند 1% هستند، زیرا در این درجه پیوند متقاطع،{8}DC خوب است، خاصیت تورم دارد و ساختار شبکه ای سه بعدی دارد و مولکول های واکنش دهنده می توانند آزادانه در داخل رزین حرکت کنند. مهمترین بخش رزین بازوی اتصال است که در یک انتها به رزین متصل شده و در انتهای دیگر به عنوان محل واکنش عمل می کند. رزین هایی که در حال حاضر به طور گسترده استفاده می شوند عبارتند از: PAM، MBHA، Wang، 2-Cl-Trt، Rink-Amide-MBHA wait. در PAM، MBHA در استراتژی BOC استفاده می شود، زیرا در برابر اسید بسیار پایدار است، باید HF باشد، TFMSA فقط در شرایط اسیدی قوی قابل برش است.

پس از تکمیل سنتز پپتید فاز جامد، باید یک معرف برش مناسب برای جدا کردن پپتید از رزین انتخاب شود و سپس با اتر یخچالی رسوب داده شود، رسوب را با سانتریفیوژ جمع آوری کرده و HPLC جدا، خالص و منجمد کنید تا محصول نهایی پپتید به دست آید.

با توجه به رزین های مختلف و توالی اسید آمینه انتخاب شده، روش های برش انتخاب شده در حین برش دقیقاً یکسان نیستند. به طور کلی، شرایط برش در شرایط اسیدی انتخاب می شود. برای PAM، رزین MBHA، معمولاً برش HF استفاده می‌شود، p{2}}cresol، p-مرکاپتوفنول، آنیزول و سایر معرف‌ها باید در طول فرآیند برش اضافه شوند. و برای Wang، Rink-آمید، رزین Trt، که معمولاً از برش TFA استفاده می‌شود، اتیلن گلیکول، سولفید آنیزول، آب، تری ایزوپروپیل سیلان، فنل و غیره را در طول فرآیند برش اضافه کنید.

این معرف های افزودنی عمدتاً به عنوان معرف های جذب کربوکاتیون استفاده می شوند. هدف جذب کربوکاتیون تولید شده در طی واکنش برش و کاهش واکنش های جانبی ناشی از حمله این یون های کربوکاتیون به برخی زنجیره های جانبی اسید آمینه است. اسیدهای آمینه ای که احتمال بیشتری برای ایجاد واکنش های جانبی دارند عبارتند از: Trp، Tyr. دوز معرف برش به طور کلی 10-15 میلی لیتر در گرم رزین است.

نسبت‌های برش متداول: HF/p-cresol/p-thiocresol (90/5/5)، TFA/TIS/EDT/H2O (94/1/2.5/2.5)، واکنش معمولاً در دمای اتاق 2h-4h انجام می‌شود.

در سنتز پپتید فاز جامد، اغلب با مشکل شکست سنتز پپتید یا بازده سنتز پایین مواجه می‌شویم. دلیل اصلی به دلیل توالی پپتیدی است، زیرا برخی از توالی‌های پپتیدی روی رزین تشکیل می‌شوند. -تا کردن، خاصیت تورم رزین را تغییر می‌دهد و همچنین ممکن است محل‌های فعال واکنش را در رزین مدفون کند و ادامه واکنش را دشوار کند. گزارش های فعلی حاکی از آن است

از حلال های مخلوط، DMSO/DMF، محلول 6N گوانیدین/DMF استفاده کنید

دمای واکنش را افزایش دهید یا از روش مایکروویو استفاده کنید

از نمک های آشفته، LiCl، NaClO4 صبر کنید.

از رزین‌هایی با خاصیت تورم بهتر PEG-رزین PS استفاده کنید و در عین حال بار رزین را کاهش دهید (0.05-0.2 mmol/g)

​